淡水浮游藻類監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范
1 范圍
本文件規(guī)定了淡水浮游藻類的監(jiān)測(cè)原則、試劑和材料、儀器和設(shè)備、監(jiān)測(cè)步驟、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制要求。
本文件適用于湖泊、水庫(kù)、河流等水體類型中淡水浮游藻類(粒徑>3μm)的監(jiān)測(cè)。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范
SL 733 內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程
DB32/T 3202 湖泊水生態(tài)監(jiān)測(cè)規(guī)范
3 術(shù)語(yǔ)和定義
GB/T 20000.1界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1 浮游藻類 planktonic algae
水中營(yíng)浮游生活方式的藻類植物，易于在風(fēng)和水流的作用下作被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，不包括細(xì)菌(藍(lán)藻除外)和其他植物，淡水中常見(jiàn)浮游藻類主要包括藍(lán)藻(Cyanophyta)、綠藻(Chlorophyta)、硅藻(Bacillariophyta)、裸藻(Euglenophyta)、甲藻(Pyrrophyta)、金藻(Chrysophyta)、黃藻(Xanthophyta)和隱藻(Cryptophyta)等門類。
3.2 浮游藻類優(yōu)勢(shì)種 dominant species of planktonic algae
浮游藻類群落中在數(shù)量或生物量方面占有優(yōu)勢(shì)地位的種類，對(duì)群落結(jié)構(gòu)和群落環(huán)境的形成有明顯控制作用的種類。
3.3 浮游藻類密度 planktonic algae density
單位體積中某種類或全部浮游藻類的數(shù)量。本文件規(guī)定浮游藻類密度以細(xì)胞數(shù)表示，單位為cells/L。
3.4 浮游藻類生物量 planktonic algae biomass
單位體積中某種類或全部浮游藻類的質(zhì)量。本文件規(guī)定浮游藻類生物量以濕重表示，單位為mg/L。
3.5 藻類水華 algal bloom
淡水水體中藻類大量繁殖的一種自然生態(tài)現(xiàn)象，表觀特征為懸浮在水中或水色明顯變化。
4 監(jiān)測(cè)原則
4.1 科學(xué)性原則
監(jiān)測(cè)斷面(點(diǎn)位)及監(jiān)測(cè)結(jié)果應(yīng)具有代表性，能夠全面反映監(jiān)測(cè)區(qū)域淡水浮游藻類的整體狀況。
4.2 可操作性原則
淡水浮游藻類監(jiān)測(cè)需要綜合考慮人力、資金和后勤保障等條件，充分利用現(xiàn)有資源，立足于環(huán)境監(jiān)測(cè)業(yè)務(wù)化及環(huán)境管理需求。
4.3 持續(xù)性原則
考慮到生物群落演替長(zhǎng)期性、復(fù)雜性等特點(diǎn)，建議監(jiān)測(cè)斷面(點(diǎn)位)、方法、時(shí)間和頻次等一經(jīng)確定，應(yīng)保持延續(xù)性，對(duì)水生態(tài)環(huán)境狀況持續(xù)跟蹤。
4.4 保護(hù)性原則
監(jiān)測(cè)以保護(hù)和恢復(fù)為最終目標(biāo)，因此在監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)避免對(duì)野生生物造成傷害，避免超出客觀需要的采樣。
4.5 安全性原則
野外監(jiān)測(cè)相關(guān)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，并做好安全防護(hù)措施。
5 試劑和材料
5.1 本文件所用試劑均應(yīng)為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?、蒸餾水或同等純度的水。
5.2 魯哥氏液：稱取60g碘化鉀溶于100mL蒸餾水中，待完全溶解后，加入40g碘，搖動(dòng)至碘完全溶解，加蒸餾水定容到1000mL，制成魯哥氏液，然后貯存于磨口棕色試劑瓶中。
5.3 甲醛溶液：φ(HCHO)=37%～40%。
5.4 鹽酸溶液：φ(HCL)=37%。
5.5 硝酸溶液：ρ(HNO3)=1.42 g/mL。
5.6 過(guò)氧化氫溶液：φ(H2O2)=30%。
5.7 乙醇溶液：φ(C2H6O)=75%。
6 儀器和設(shè)備
6.1 野外采樣
6.1.1 采水器：2L。
6.1.2 水桶：5L或10L。
6.1.3 25號(hào)浮游生物網(wǎng)：200目，篩絹孔徑為0.064mm。
6.1.4 具刻度無(wú)色透明采樣瓶：1L、2L、5L等。
6.1.5 具刻度塑料螺口樣品瓶：100mL。
6.1.6 塞氏盤：ø20cm，配重錘及帶刻度的繩索。
6.2 樣品前處理
6.2.1 虹吸管：ø2mm～3 mm。
6.2.2 尖頭玻璃管：與虹吸管配套，尖頭部位使用孔徑0.064mm的篩絹包裹封蓋。
6.2.3 洗耳球。
6.2.4 玻璃試管：15mL。
6.2.5 離心管：15mL，玻璃或塑料。
6.2.6 水浴鍋。
6.2.7 離心機(jī)：相對(duì)離心力可達(dá)到1000×g(轉(zhuǎn)速3000rpm～4000rpm)以上。
6.2.8 漩渦混勻器。
6.2.9 超聲波清洗儀。
6.3 實(shí)驗(yàn)室顯微鏡觀測(cè)
6.3.1 顯微鏡：配備10倍、20倍、40倍或60倍物鏡、100倍物鏡，10倍或15倍目鏡。
6.3.2 目測(cè)微尺和臺(tái)測(cè)微尺。
6.3.3 浮游生物計(jì)數(shù)框：0.1mL，內(nèi)框20mm×20mm，橫豎劃分為10×10行，共100個(gè)計(jì)數(shù)小格，每個(gè)計(jì)數(shù)小格內(nèi)框?yàn)?mm×2mm。
6.3.4 移液器：最大量程為100μL～200μL，也可用刻度滴管代替。
6.3.5 載玻片：25.4mm×76.2mm，厚0.8mm。
6.3.6 蓋玻片：22mm×22mm，厚0.17mm。
6.3.7 鑷子。
6.3.8 計(jì)數(shù)器。
6.4 其他輔助設(shè)備
6.4.1 防護(hù)設(shè)備：救生衣、水褲、防水服、防曬服、防寒服、高筒膠鞋、橡膠手套、急救包等。
6.4.2 現(xiàn)場(chǎng)記錄設(shè)備：GPS、照相機(jī)、中性筆、記號(hào)筆、鉛筆、標(biāo)簽、采樣記錄表等。
6.4.3 一般實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)常用儀器和設(shè)備。
7 監(jiān)測(cè)步驟
7.1 野外采樣程序
7.1.1 采樣點(diǎn)位的確定
7.1.1.1 根據(jù)水體的自然生態(tài)類型、人類干擾的空間特性和點(diǎn)位周邊生態(tài)環(huán)境等確定采樣點(diǎn)位。
7.1.1.2 監(jiān)測(cè)斷面的布設(shè)和采樣點(diǎn)位的確定應(yīng)符合HJ/T 91的規(guī)定。
7.1.2 監(jiān)測(cè)時(shí)間的設(shè)定
常規(guī)監(jiān)測(cè)一般按季節(jié)或水期開(kāi)展，在條件允許的情況下，建議每月監(jiān)測(cè)一次。專項(xiàng)性監(jiān)測(cè)頻次視具體情況確定。發(fā)生藻類水華時(shí)段可適當(dāng)加密監(jiān)測(cè)頻次。監(jiān)測(cè)時(shí)間的確定需考慮下列事項(xiàng)：
a)若進(jìn)行逐季或逐月監(jiān)測(cè)，各季或各月監(jiān)測(cè)的時(shí)間間隔應(yīng)基本相同；
b)同一湖泊(水庫(kù))的監(jiān)測(cè)應(yīng)力求水質(zhì)、水文及生物采樣時(shí)間上同步；
c)考慮到浮游藻類的日變化，監(jiān)測(cè)時(shí)間盡量選擇在一天的同一時(shí)段。
7.1.3 采樣斷面(點(diǎn)位)環(huán)境觀測(cè)
采集樣本前，應(yīng)先對(duì)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境情況進(jìn)行觀察、記錄和拍照；盡可能全面檢測(cè)和記錄水深、透明度、pH值、水溫、溶解氧等常規(guī)理化指標(biāo)及水文信息；也可以同步采集水樣進(jìn)行水化學(xué)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室分析。
7.1.4 樣品的采集
7.1.4.1 定量樣品采集
采集浮游藻類樣品時(shí)，需根據(jù)采樣點(diǎn)位的水深設(shè)置采樣層次。水深<5m或混合均勻的水體，不分層，在水面下0.5m處采集；水深為5m～10m時(shí)，分別在水面下0.5m處和透光層(深度以3倍透明度計(jì))底部采集；水深>10m時(shí)，分別在水面下0.5m處、1/2透光層和透光層底部采集。分層采樣按照由淺到深的順序，使用采水器采集1L～5L水樣。將各層次采集的樣品倒入事先準(zhǔn)備的清潔水桶，充分混勻后，取1L～5L水樣裝入樣品瓶。
7.1.4.2 定性樣品采集
7.1.4.2.1 浮游藻類定性樣品的采集應(yīng)在定量樣品采集結(jié)束后進(jìn)行。
7.1.4.2.2 用25號(hào)浮游生物網(wǎng)在選定采樣點(diǎn)的水面下0.5m處作“∞”形循環(huán)緩慢拖動(dòng)，拖動(dòng)時(shí)間1min～3min。水樣采集完畢后，將網(wǎng)從水中提出，待水濾去，輕輕打開(kāi)浮游生物網(wǎng)底管的活栓，使水樣流入樣品瓶中。
7.1.5 樣品的固定
7.1.5.1 定量和定性樣品現(xiàn)場(chǎng)加入水樣終體積1%～1.5%的魯哥氏液進(jìn)行固定。
7.1.5.2 藻類水華樣品可根據(jù)情況酌情增加固定劑用量。
7.1.6 樣品的保存
7.1.6.1 采集的樣品應(yīng)盡快固定，未固定的樣品即活體定性樣品，在4℃～10℃條件下避光保存，保持樣品瓶中的樣品上方留有一半以上的空間，并應(yīng)在3 h內(nèi)鏡檢。
7.1.6.2 魯哥氏液固定的樣品在1℃～5℃條件下避光保存不得超過(guò)12個(gè)月，常溫保存不得超過(guò)3個(gè)月。長(zhǎng)期保存時(shí)，加入甲醛溶液，用量為水樣終體積的2%。保存時(shí)，每隔2～3周檢查固定劑(定量樣品可以觀察魯哥氏液顏色是否變淡)，必要時(shí)進(jìn)行添加，直至完成種類鑒定。
7.1.7 樣品標(biāo)識(shí)和記錄
在樣品瓶外側(cè)標(biāo)注樣品編號(hào)、采樣日期、水體名稱、采樣點(diǎn)位、采樣人姓名以及樣品類型。現(xiàn)場(chǎng)記錄表格可參照SL 733的附錄A。
7.2 實(shí)驗(yàn)室分析程序
7.2.1 顯微鏡的標(biāo)尺校準(zhǔn)
校準(zhǔn)方法參見(jiàn)附錄A。
7.2.2 定性分析
7.2.2.1 前處理
7.2.2.1.1 定性樣品一般不做沉淀、濃縮，如溶液過(guò)多，可適當(dāng)棄去部分上清液，再進(jìn)行種類鑒定。
7.2.2.1.2 如果樣品中硅藻過(guò)多，顯微鏡下難以鑒別硅藻種類，需要對(duì)硅藻內(nèi)含物進(jìn)行去除，前處理方法參見(jiàn)附錄B。
7.2.2.2 種類鑒定
用移液器或刻度滴管吸取60μL左右樣品瓶底部的定性樣品滴到載玻片上，用鑷子蓋上蓋玻片，制成標(biāo)本片，在顯微鏡下，盡量鑒定到種，形態(tài)學(xué)可以區(qū)分的分開(kāi)列出，常見(jiàn)種給出種名。每個(gè)樣品應(yīng)觀察不少于2～3個(gè)標(biāo)本片。建議有條件的實(shí)驗(yàn)室對(duì)于一些不能確認(rèn)的優(yōu)勢(shì)種或常見(jiàn)種，開(kāi)展分子生物學(xué)鑒定。
7.2.2.3 記錄
在浮游藻類分析記錄表填寫樣品相關(guān)信息。實(shí)驗(yàn)室分析表格可參照SL 733的附錄B。重要的或優(yōu)勢(shì)種類應(yīng)拍照記錄。
7.2.3 定量分析
7.2.3.1 前處理
一般前處理方法參見(jiàn)附錄C。當(dāng)發(fā)生藻類水華時(shí)，可考慮原樣或者原樣稀釋后計(jì)數(shù)。在藻類應(yīng)急監(jiān)測(cè)或要求快速報(bào)送數(shù)據(jù)的情況下，可采用原樣固定離心后計(jì)數(shù)(準(zhǔn)確量取100mL～200mL混勻后的水樣于離心管中，以相對(duì)離心力1000×g(轉(zhuǎn)速3000rpm～4000rpm)離心10min～15min，吸去部分上清液，定容至5mL～10mL，漩渦混勻洗下粘附在管壁上的藻類細(xì)胞，超聲分散處理10min～15min，此懸濁液用于下一步鏡檢)。
7.2.3.2 種類鑒定和計(jì)數(shù)
將樣品充分搖勻(手工或旋渦混勻器混勻)，用移液器吸取0.1mL樣品到計(jì)數(shù)框中。移入之前用鑷子將蓋玻片斜蓋在計(jì)數(shù)框上，在計(jì)數(shù)框的一邊進(jìn)樣，另一邊保持出氣，避免氣泡產(chǎn)生。注滿后把蓋玻片移正。種類鑒定要求同7.2.2.2，按種計(jì)數(shù)。藻類數(shù)量較多時(shí)可使用計(jì)數(shù)器，有條件的實(shí)驗(yàn)室可結(jié)合軟件分析技術(shù)對(duì)藻類的種類進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法參見(jiàn)附錄D。
7.2.3.3 藻類密度計(jì)算